可視的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱(chēng)為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。趨化性對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣*。

在生物材料移植的時(shí)候，快速的纖維血管化是成功移植的先決條件之一。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織型纖溶酶原激活物（tPA）或纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）在纖維蛋白溶解中都發(fā)揮了重要的作用。這三種蛋白近均被報(bào)道在無(wú)可溶纖維蛋白的細(xì)胞過(guò)程中有表現(xiàn)出*的作用，比如細(xì)胞粘附，遷移和增殖。

德國(guó)的科研人員發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)皮細(xì)胞做趨化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)uPA，tPA和PAI-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移行為都有顯著的影響。

Components of the plasminogen activation system promote engraftment of porous polyethylene biomaterial via common and distinct effects.

Reichel CA, Hessenauer ME, Pflieger K, Rehberg M, Kanse SM, Zahler S, Krombach F, Berghaus A, Strieth S.
PloS one, 2015, 10.1371/journal.pone.0116883

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

• 倒置顯微鏡，具有4X相差物鏡和定時(shí)拍照功能（Nikon）
• 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO₂）
• 可選配置：全自動(dòng)載物臺(tái)，自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)
• 分析軟件：手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
• HUVEC 細(xì)胞  （Human umbilical vein endothelial cells from Promocell）
• tPA，uPA，PAI-1 （Sino Biological）
• Matrigel （Corning）
• ECGM培養(yǎng)基 (Promocell）
• 細(xì)胞趨化載玻片（圖一）        （ibidi）

圖一，ibidi 細(xì)胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細(xì)胞種在中間通道，兩邊的儲(chǔ)液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測(cè)可以得到細(xì)胞對(duì)刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入uPA、tPA或PAI-1，另外一邊放入培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，兩邊都放培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

• 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

1. 實(shí)驗(yàn)步驟

• 將細(xì)胞與30%Matrigel的ECGM稀釋液混合，密度為3×10⁶ cells/cm²，直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）

圖二，在觀測(cè)通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液

• 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠凝結(jié)
• 膠凝結(jié)后后分別在兩邊儲(chǔ)液池中加入60μl的30 ng/mL的uPA、20 ng/mL的tPA或1 μg/mL的PAI-1和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（+/-）（圖三）

圖三：加入X-lkd IIIA4抗體（紅色）和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）

l 在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（-/-）或均加入趨化因子為陽(yáng)性對(duì)照（+/+）（圖四）

圖四：加入無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）作為空白對(duì)照

• 按說(shuō)明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
• 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行20小時(shí)的觀測(cè)，每10分鐘采集一張圖片

• 圖像數(shù)據(jù)處理

1. 手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤

• 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
• 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開(kāi)模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開(kāi)始記錄細(xì)胞軌跡
• 選擇一個(gè)細(xì)胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞，*點(diǎn)擊后，會(huì)有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
• 統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
• 至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖五：uPA，tPA和PAI-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移行為的影響。A）為在趨化因子存在下，HUVEC細(xì)胞的趨向性運(yùn)動(dòng)軌跡。B）為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果說(shuō)明，HUVEC細(xì)胞對(duì)uPA，tPA和PAI-1都有證趨向行為。