環(huán)形細(xì)胞侵襲實驗--使細(xì)胞侵襲的過程可視化

腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要特征。為了研究腫瘤細(xì)胞侵襲過程的機制，一系列體外細(xì)胞實驗建立起來，用于研究細(xì)胞侵襲基底膜和基質(zhì)的過程。體外侵襲實驗首先是采用人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐漸凝固成膠，結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。通常的實驗是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過。實驗之后通過對穿過“基質(zhì)膜”的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，來確定細(xì)胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細(xì)胞在生物狀態(tài)下的侵襲過程，但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性，使得直接觀察細(xì)胞偽足和骨架變化變得非常困難。

英國的科研人員改進(jìn)了腫瘤侵襲實驗，設(shè)計了一種環(huán)形細(xì)胞侵襲實驗，使得操作進(jìn)一步簡化，并且也能模擬3D侵襲。重要的是，能夠使侵襲過程中的活細(xì)胞或者是固定的細(xì)胞可視化。借用這個實驗方法，研究人員發(fā)現(xiàn)侵襲過程中主要有蛋白酶參與其中。研究發(fā)現(xiàn)，在3D侵襲的細(xì)胞中蛋白酶會聚集在偽足和細(xì)胞的粘附點上。

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

（一）實驗材料

• 細(xì)胞:   MDA-MB-231
• 實驗耗材:  傷口愈合插件         （ibidi，80209）

               玻璃底培養(yǎng)皿      （ibidi，81158） 

• 試劑:    Matrigel           （BD）

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

（二）實驗步驟

• 將ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養(yǎng)皿中間
• 在插件外部鋪 6 × 10⁵ MDA-MB-231細(xì)胞，等待細(xì)胞貼壁
• 細(xì)胞貼壁后移除傷口愈合插件，在細(xì)胞形成一個0.8cm²的空白區(qū)域
• 加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），將培養(yǎng)皿內(nèi)層剛好鋪滿，能形成一個0.8mm厚度的“基質(zhì)膜”
• 孵育2小時，使Matrigel固化，加入培養(yǎng)基
• 在37^。C培養(yǎng)箱中孵育24小時。
• 以4%多聚甲醛溶液固定30分鐘，并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色

• 實驗結(jié)果

1、使用環(huán)形細(xì)胞侵襲實驗?zāi)軌蛴^測到細(xì)胞侵襲中的活動（圖一）

圖一：MDA-MB-231細(xì)胞在環(huán)形細(xì)胞侵襲過程中形成了侵襲鏈：A）MDA-MB-231細(xì)胞在matrigel中形成了一個長的侵襲鏈 B）勤洗臉的免疫熒光圖，紅色為Actin，藍(lán)色為細(xì)胞核

2. 使用環(huán)形侵襲實驗?zāi)軌蛴涗泴Ρ惹忠u速率和侵襲面積（圖二）

圖二：MDA-MB-231細(xì)胞侵襲過程受MMP調(diào)控。加入25μM的GM6001能顯著的減緩侵襲速率和侵襲面積。