探討流體剪切力對細胞活動的影響

探討流體剪切力對細胞活動的影響--流體剪切力對細胞吸收人造細胞器的影響

      丹麥奧胡斯大學的納米科學近日在SMALL雜志上發表了一篇關于納米材料作為有細胞活性人造細胞器的文章。文章介紹了個有趣的現象：細胞在剪切力條件下培養的時候，會吸收更多的納米顆粒，并且沒有附加的細胞毒性。
    文章中采用了內皮細胞和巨噬細胞做為實驗細胞。將細胞培養在ibidi通道載玻片中，之后使用含有納米顆粒的培養基，以一定的剪切力刺激細胞，細胞吸收的納米顆粒的量比靜置狀態下有顯著的升高。
        分享一下這個實驗的細節，或許大家可以從中找到自己研究領域的靈感。

一、實驗準備實驗材料及設備
1.細胞： 內皮細胞、巨噬細胞
2.納米顆粒：pPDA：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚多巴胺（dopamine）
             pPEG：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚乙二醇（ethylene glycol）
             pRGD：在800nm直徑的二氧化硅表面包被L-精氨酸、甘氨酸和L-天門冬氨酸的多聚物（Arginylglycylaspartic acid ( RGD ) is a tripeptide composed of L -arginine , glycine , and L -aspartic acid）
3.培養耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI0.4 Luer （ibidi，Germany，80606）
             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
             串聯管（ibidi，Germany，10830）
             封口夾 
1.儀器設備：ibidi流體剪切力系統，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二.實驗方法
在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養箱中放置第二天，排除由于溫度差產生的微量氣泡。

一）培養細胞
準備內皮細胞和巨噬細胞，按照常規細胞培養方法進行培養。好使用比較健康的內皮細胞，以防在做流體實驗時候細胞不能穩定貼壁。

按照下面流程鋪細胞：
1.按每通道10000個巨噬細胞和40000個內皮細胞將細胞鋪于通道載玻片的中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿整個通道。
2.蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細胞培養箱中培養半小時，等待細胞貼壁。細胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個注液孔中分別加入60μl培養基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養基。
3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養箱進行培養2-4小時左右，等到細胞剛剛長滿為單細胞層，即可開始實驗。注意，要使用單層細胞進行剪切力實驗，使每個細胞均受到均勻的剪切力。

二.搭建流體系統
1.將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入含納米顆粒的7.5ml培養基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統，在任務欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統將自動運行下面任務，用于去除氣泡。（表一）
  

2.連接通道載玻片。使用串聯管，將通道串聯起來。這樣可以在同一個條件，同一種液體的刺激下培養不同的樣本。

在細胞貼壁后，將串聯管如如圖示插入串聯管

在每一個注液孔中加滿培養基，要注意不能把氣泡加入在注液孔中。

用1ml的無菌注射器吸滿培養基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。

小心推入培養基，直到*個串聯管有培養基微微冒出。

小心的將串聯管彎過來，插入相鄰的注液孔中。不要產生氣泡。

繼續推動注射器，直到第二根串聯管也被充滿，繼續推動注射器充滿下一根串聯管。

重復上面的操作，繼續充滿所有的通道和串聯管。

將所有的串聯管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。

小心將灌流管的一個魯爾接頭從聯通管中拔出，插入后一個注液孔中。

小心將注射器移除，在注液孔中加滿培養基，將灌流管的另一個接頭插入。

串聯灌流系統搭建完成。

三 實驗結果

如圖所示，對于內皮細胞和巨噬細胞，在剪切力為г4=4 dyn/cm2時比靜置條件г0吸收pRGD這種納米材料有非常顯著的升高。