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    ibiPoreSiN玻璃膜上人類內(nèi)皮細(xì)胞在剪切力環(huán)境下的培養(yǎng)方案

    更新時(shí)間:2025-03-06   更新時(shí)間:2025-03-06   點(diǎn)擊次數(shù):300次

      本應(yīng)用說明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內(nèi)創(chuàng)建單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的方案。在涂層和細(xì)胞接種后,使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)將內(nèi)皮單層暴露于單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力下。該方案的重點(diǎn)是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統(tǒng)施加剪切應(yīng)力相結(jié)合。



      ibidi用于研究動(dòng)態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸?shù)慕鉀Q方案:

      

      • µ-Slide ibiPore SiN

      

      • ibidi Pump System

      

      相關(guān)文件:

      

      •Instructions µ-Slide ibiPore SiN

      

      •Instructions ibidi Pump System

      

      

      1、材料

      

      •µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號(hào):85216-S,ibidi,德國)

      

      •ibidi Pump System泵系統(tǒng) (貨號(hào):10902.ibidi,德國)

      

      •灌流管套裝紅色,15cm,內(nèi)徑1.6mm (貨號(hào):10962.ibidi,德國)

      

      •螺旋式管道夾 (貨號(hào):10861.ibidi,德國)

      

      •人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,HUVEC,(貨號(hào):C-12203.PromoCell,德國)

      

      •內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(貨號(hào):C-22010.PromoCell,德國),輔以內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充混合液(貨號(hào):C-39215.PromoCell,德國)

      

      •Accutase細(xì)胞解離液(貨號(hào):A1110501.Gibco)

      

      •IV型膠原蛋白(貨號(hào):354233.Corning)

      

      •標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(無菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、PBS等)

      

      重要提示:在實(shí)驗(yàn)前一天,將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片、培養(yǎng)基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜,這對(duì)防止氣泡隨時(shí)間產(chǎn)生至關(guān)重要。

      

      2、包被載玻片

      

      •按照生產(chǎn)商的說明,將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度

      

      •在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細(xì)的涂層方案見 µ-Slide ibiPore SiN 使用說明)

      

      •吸干涂層溶液

      

      •用PBS沖洗兩次

      

      •在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片,然后再接種細(xì)胞

      

      3、制備及接種細(xì)胞

      

      •在添加了混合補(bǔ)充劑的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC

      

      •用 Accutase 細(xì)胞解離液處理細(xì)胞2分鐘,使其分離

      

      •收集細(xì)胞懸液

      

      •離心細(xì)胞懸浮液,用生長培養(yǎng)基稀釋以獲得所需的濃度

      

      •計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整至2x106 cells/ml的濃度,使細(xì)胞貼壁后的光學(xué)匯合度達(dá)到100%

      

      • 將細(xì)胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細(xì)胞播種的詳細(xì)說明請(qǐng)參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說明)。

      

      •在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)兩小時(shí),讓細(xì)胞貼壁。

      

      重要提示:用于繁殖的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞不應(yīng)生長到接近100%的光融合。融合的單層進(jìn)入生長抑制狀態(tài),這會(huì)阻止細(xì)胞增殖并改變細(xì)胞的生理機(jī)能。只有在需要單層培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,才建議采用100%匯合。

      

      4、灌注

      

      •在相差顯微鏡下控制細(xì)胞貼壁的程度

      

      •為清除 ibidi Pump System 泵系統(tǒng)中的氣泡,在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前,先讓其運(yùn)行1-2小時(shí)

      

      重要提示:實(shí)驗(yàn)當(dāng)天如何清除系統(tǒng)中的氣泡,請(qǐng)參閱ibidi Pump System泵系統(tǒng)使用說明

      

      •用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道

      

      •將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上

      

      •緩慢打開夾緊的管道,以盡量減小壓力峰值

      

      •按照下表中的參數(shù)開始灌注實(shí)驗(yàn)。開始時(shí)低流量是使細(xì)胞適應(yīng)剪切應(yīng)力的必要條件

      

      

      5、結(jié)果

      

      

      人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm2流體剪切力條件下培養(yǎng)(A)和靜態(tài)條件下(B)培養(yǎng)24小時(shí),窗口大小2mm×2mm,4倍物鏡,相差,比例尺200µm

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