ibidi血管生成、侵襲等實驗現象

卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內的多種組織內的，具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤。卡西波肉瘤KS已經被鑒定出多種細胞標記物，但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發(fā)現卡西波肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）能夠使大鼠的原代間充質干細胞（MSCs）感染，變形，并且重新編輯，使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中，科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質干細胞，包括骨髓（MSCbm），脂肪組織（MSCa），牙髓，牙齦組織（GMSC），和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的穩(wěn)定株。其中，這些細胞表達了混合的KS標記物，并且顯現出不同的血管生成、侵襲和變形的現象，而LTC-KMSCs表現出比未感染細胞更低的增殖率。進而研究人員發(fā)現KSHV介導的血管生成是通過KSHV介導的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明，在人體內MSCs是KSHV的靶細胞，會建立起多種KSHV感染的模型。

研究人員采用各種MSCs，鋪在基質膠上，孵育8小時，對比不同細胞的分枝數和節(jié)點數。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）實驗材料和實驗方法

1）細胞：  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2）培養(yǎng)基：      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3）基質膠：    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4）耗材：    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506)

5）其他：        細格紙                                  

（二）實驗步驟

1）準備基質膠

①　將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中，注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。

②　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

③　準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。

④　將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

⑤　37℃至少孵育30分鐘，使基質膠固化。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

3）鋪細胞

①　每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。

②　將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

③　每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。

④　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。

⑤　蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

4）采集圖像并統(tǒng)計結果

37度 5% CO2孵育8小時后，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數和節(jié)點數進行測量和統(tǒng)計。

三）實驗結果

對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質干細胞，KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集，100倍放大倍數。

1. 為了研究KSHV相關的miRNA的作用，對比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10個pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉錄病毒重新表達這10個miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細胞的血管生成。發(fā)現這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強。兩組結果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數采集圖像。